发布时间：2025-12-18
I. 介绍：多色免疫荧光染色流式细胞分析中荧光光谱重叠的补偿
当使用流式细胞仪同时进行多色免疫荧光分析时，所使用的不同荧光色的固有光谱重叠，如果不进行校正，将导致给定荧光色发射到“不适当”的检测器中。这种对光谱重叠补偿的缺乏可能导致对多色等高线图上的假阳性种群和人工种群数据的误解。然而，通过使用适当的单染色和双染色对照样品，可以通过减去不需要的信号来补偿光谱重叠，并且可以成功地实现对多色染色细胞的精确流式细胞分析。
与异硫氰酸荧光素（FITC）、R-phychoerythrin （PE）和PE- cy5偶联的单克隆抗体可用于分析细胞群内的多种抗原决定因子。这样的分析可以在单激发波长（488nm）下完成。FL1探测器测量FITC发射为绿色信号（荧光峰为530 nm）， FL2探测器测量PE发射为橙色信号（荧光峰为575 nm）， FL3探测器测量PE- cy5发射为紫色信号（荧光峰为670 nm）。然而，在FITC发射中存在大量的橙色荧光，在R-PE发射中存在一些绿色荧光，等等。这种光谱重叠，如果不加以纠正，将导致荧光信号被不适当的检测器拾取。补偿是纠正这种重叠的过程；它是对不需要的信号进行电子减法，以消除频谱溢出的影响。通过补偿，用一种荧光染料染色的细胞样品的荧光测量在电子上被迫与未染色细胞的荧光测量相同，对于剩下的两个不适当的检测器。缺乏补偿或不适当的补偿设置可以产生假阳性和人为的直方图形状。例如，如果在多色分析中荧光染色的样品补偿不足，则可能在双色等高线图上感知到假双阳性群体，并且数据被误解。为了防止这种补偿相关的伪影在三色免疫荧光染色，重要的是设置补偿多色分析使用单色，然后双色控制。也就是说，设置补偿的基础上，染色细胞与每个抗体荧光染料单独。接下来，微调补偿设置与2色染色控制。对于这两个颜色的控制步骤，染色单独的阳性群体和阴性群体是最有帮助的调整荧光信号沿适当的轴。为了使结果标准化并长期监测仪器性能，应每天使用荧光参考标准和适当的自动校准/补偿软件初始设置颜色补偿。
II. 多色流式细胞分析设置补偿程序
1.每天根据实验室建立的规程执行仪器校准/标准化程序。
2.运行未染色（自体荧光对照）细胞样本。调整FSC（前向散射）和SSC（侧向散射）探测器设置，使感兴趣的细胞按比例显示，并可以根据需要进行画门。
3.在对感兴趣的细胞进行画门时，调整FL1、FL2和FL3检测器设置，使自身荧光背景大致在荧光强度直方图对数尺度的前十年内。将自动荧光对照（未染色细胞）与染色细胞阳性对照进行比较，以确认染色细胞的每个参数都符合标准。
4.设置补偿基于每个抗体-荧光染料偶联物单独染色的运行细胞（单染色）。在监测两色点图时，调整补偿设置，使阳性染色的细胞直接与未染色的背景细胞一致，并与适当的轴平行。例如，使用pe偶联mAb染色的细胞群，调整FL1-%FL2设置，使FL2阳性群体与FL2阴性群体垂直对齐（即，在FL2与FL1的点阵图上）。然后，使用fitc偶联的mAb染色细胞群，调整FL2-%FL1的设置，使FL1群体与FL1阴性群体水平对齐（即，在FL2与FL1的点阵图上）。以此类推第三种颜色，调整FL2-%FL3和FL3-%FL2。
5.接下来，通过运行用1)FITC和PE单克隆抗体和2)PE和PE- cy5单克隆抗体染色的双色对照细胞样品进行微调补偿。选择对互斥细胞群进行染色的对照单克隆抗体是最有帮助的。或者，可以在混合两种不同的单染色对照的细胞管上进行双色补偿调整：例如，混合FITC和PE标记的细胞的等分。这将避免相互排斥的细胞标记的需要。每个群体的荧光标记细胞应包含在适当的象限内。在一些流式细胞仪上，FL1和FL3不能直接相互补偿。因此，FITC/PE-Cy5控制对2色补偿设置没有帮助。
6.检查三色染色细胞群；前面的步骤应该已经充分补偿了信号，这样就不需要对这个样本进行进一步的调整。
7.开始收集控制和样本数据并保存。
8.补偿设置可能需要重新调整每个多色染色实验。因此，对于每个多色实验，需要单色和双色染色对照，以便步骤3 - 7可以重复。为了尽量减少试剂组之间的调整量，请使用每种荧光染料中最亮的染色试剂/细胞进行初始补偿设置。
关注培镨生物，了解更多相关知识