发布时间：2026-03-16
样本制备：
1. 细胞染色基本流程：FVS→表面染色→固定破膜→胞内染色。每一步之间需做好细胞清洗工作。
2. 染色之前必须进行细胞计数，选用合适浓度的细胞用于染色（具体细胞浓度参考抗体说明书）。
3. 死细胞往往有较高的荧光背景以及更强的非特异性染色，因此强烈建议使用鉴定细胞死活的染料去除样本中的死细胞信号。
4. 如果只做胞膜染色且细胞未经固定处理，可以使用PI或7-AAD、DAPI等核酸染料染色死细胞，染色后直接上机检测，不可离心清洗；如果有胞内染色，则需要使用FVS试剂来区分死、活细胞。值得注意的是，FVS试剂亦不能用于已经固定过的细胞样本。
5. FVS染色时，为防止游离蛋白中和FVS染料，要在染色前通过离心清洗去除样本中的游离蛋白。同样，必须使用含有蛋白的液体终止FVS染色。
6. 使用BD红细胞裂解液时，需按操作说明使用室温蒸馏水配置红细胞裂解工作液，并在使用前充分混匀，切勿使用PBS配置。实验操作中，向样本中加入裂解液后需要充分混匀，裂解完毕离心后，若发现管底有红细胞沉降，需重新配置裂解液再次裂解样本。若两次裂解后仍然存在红细胞沉淀，则不推荐再次尝试裂解。红细胞裂解液工作液可4℃保存30天，但推荐现用现配。
7. 固定破膜及染色流程都应在2-8℃避光进行。Transcription Factor Buffer Set中的diluent Buffer储存及操作过程中须避免细菌污染。注意：不同类型的实验所需的固定破膜剂有所不同，用户需根据具体情况进行选择。
8. 当染色Panel中存在两个及以上的BV染料时，需要将抗体与50 uL/Test BD Horizon Buffer Stain Buffer预混合后再与细胞样本孵育，以减少染料之间的荧光干扰。
9. 同型对照（Isotype Control）的作用是模拟抗体与细胞非特异性结合的情况；Fc阻断剂（Fc Block）的作用是阻断巨噬、B细胞等细胞表面存在的可与单克隆荧光抗体Fc片段结合的受体，减少非特异性染色；荧光减一对照（FMO Control）的作用是扣除加入多种荧光抗体样本荧光背景提升的影响。
10. 关于Fc Block：BD公司用于mouse的Fc Block是anti-CD16/CD32单克隆抗体（克隆号2.4G2），封闭后不能再用克隆号的抗体检测细胞CD16/CD32的表达情况，即使不同克隆号的抗体亦不一定可用于检测，需做进一步测试；BD公司用于Human的Fc Block在封闭后不影响任何CD分子的检测。
另有实验室报道，染色前用10%血清或10%FBS/BSA孵育细胞10min具有一定封闭效果。
11. 上机检测之前需要重悬样本，防止沉降的细胞堵塞管路。如果细胞容易重新聚集，则需要在上机前用细胞筛网过滤。
12. 样本体积推荐不要超过300uL，以保证使用较低的上样压力实现快速上样，使细胞信号的CV值更小，分群更清晰。用于调整电压的样本，如未染色样本或Isotype Control，可适当增加体积以增加可用时间。
上机检测
1. 处理样本之前需确认仪器状态正常。
2. 使用同型对照样本调整电压。每个荧光通道上的信号位置大约在坐标刻度102左右。
3. 设置好所有通道的电压后需要上样一管全染的样本来确认所有荧光通道上都不会有信号超过105，否则需要降低该通道的电压，使信号低于105。
4. 推荐提前做好抗体滴定是工作，正式染色时按照抗体滴定最佳浓度加入相应抗体，如果没有做抗体滴定，在检测样本时，若发现某指标信号过强或过弱，则提示该指标的抗体可能需要做浓度滴定以寻找最佳染色浓度。
5. 推荐使用实验样本做单染后调整荧光补偿。如果某些细胞指标表达太弱，不利于做荧光补偿，则可考虑使用补偿微球（BD CompBeads）替代细胞样本制备未染色样本和单染样本。由于微球与细胞的背景荧光存在差异，自动补偿过后需要视情况对补偿矩阵进行手动微调。
6. 手动调整荧光补偿时，建议打开相关荧光通道的双指数显示（Biexponential Display），补偿效果更为直观、准确。当单阳性信号与阴性信号群体的中心店对齐时，荧光补偿值即为合适的值。
7. 各通道的电压值与荧光补偿值直接相关。一旦某通道电压值发生改变，则该通道与其它通道相关的荧光补偿值需要重新调整（FACSVerse/FACSLyric/FACSMelody具有荧光补偿值自校准功能，通常可以无需再次手动调整）。
8. 在流式细胞仪操作软件中，除了显示所有相关通道的A信号外，需要打开FSC-H、FSC-W、SSC-H、SSC-W，并用散点图展示，目的是设门排除粘连细胞。
9. 流式细胞仪使用H信号设置阈值（Threshold），因此H信号观察阈值效果最佳。
10. 收集细胞数据时，将Stopping Gate设置为靶细胞所在的Gate，并输入合适的收集细胞数（Events to Record）。