发布时间：2026-04-22
蛋白磷酸化是调控蛋白质活性与功能的核心机制，广泛参与原核及真核生物的信号转导、细胞增殖、分化等几乎所有生命活动，是细胞表达调控中最基础、普遍且重要的生物过程。
以下为培镨生物为您整理的磷酸化流式染色标准操作步骤，供实验参考：
## 一、样本制备与刺激处理
1. 将待检测样本（如人PBMC、脾细胞、细胞系等）制备成单细胞悬液，确保细胞分散均匀，无明显聚集。
2. 对细胞进行计数，调整每个样本的细胞量至1-5×10^7 个；按实验设计加入适宜刺激剂，于37℃孵育1~30min（具体孵育时间需参照对应试剂操作说明）。实验需同步设立未处理样本作为阴性对照，以排除非特异性信号干扰。
## 二、细胞裂解与固定
3. 刺激孵育结束后，迅速加入10倍体积的预热Lyse/Fix Buffer（裂解固定液），置于振荡器上低速振荡5-10次，确保细胞与试剂充分混匀。
4. 37℃恒温孵育10-12min，完成细胞裂解与固定。
5. 600g 离心6-8min，小心弃去上清液，保留试管内残余液体不超过50μL，避免细胞丢失。
6. 振荡器低速振荡混匀细胞沉淀，为后续清洗做准备。
## 三、细胞清洗与红细胞去除
7. 加入与Lyse/Fix Buffer等体积的Stain Buffer（染色缓冲液，货号：554656），轻柔混匀。
8. 600g 离心6-8min，弃上清，残余液体量控制在50μL以内，振荡器低速混匀细胞。
> **Tips**：若红细胞裂解不充分，可再次使用溶血剂处理，但该步骤累计不超过2次，以免影响细胞活性及实验结果准确性。
## 四、细胞破膜处理
9. 取0.5-2.0×10^6 个细胞，加入1mL Perm Buffer（破膜缓冲液），振荡器低速振荡混匀，使破膜试剂充分接触细胞。
> **Note**：破膜操作的细胞数量、孵育温度及时间需根据所用Perm Buffer的具体类型调整；需结合表面标记抗体及特异性磷酸化蛋白抗体的特性，选择适配的Perm Buffer Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ。
10. 600g 离心6-8min，弃上清，残余液体不超过50μL，振荡器混匀细胞沉淀。
11. 按照所选Perm Buffer的对应要求，完成细胞清洗步骤（具体操作参照试剂说明书）。
12. 用Perm/Wash Buffer Ⅰ（若使用Perm Buffer Ⅰ）或Stain Buffer（若使用Perm Buffer Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ）重悬细胞，调整细胞终浓度至5-10×10^6 个/mL。
## 五、封闭与抗体染色
13. 选做步骤：每1×10^6 个细胞中加入0.06μg Fc封闭抗体（货号：553141或553142），轻柔混匀后置于冰浴中孵育15min，减少非特异性结合。
14. 取100μL上述细胞悬液（含0.5-1×10^6 个细胞）加入12×75-mm BD Falcon 试管中，根据抗体说明书推荐用量，加入相应的BD Phosflow抗体。
15. 轻柔混匀后，于室温下避光孵育60min，避免光照影响抗体活性。
## 六、洗涤与上机检测
16. 孵育结束后，加入至少3mL Perm/Wash Buffer Ⅰ（适配Perm Buffer Ⅰ）或Stain Buffer（适配Perm Buffer Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ），轻柔混匀。
17. 600g 离心6-8min，弃上清，残余液体不超过50μL，振荡器低速混匀细胞沉淀。
18. 加入约500μL对应的Perm/Wash Buffer Ⅰ或Stain Buffer重悬细胞，充分混匀后，立即上机进行流式检测。
试剂列表
- PBS或完全培养基：Phosphate buffer saline containing CaCl2 and MgCl2,1X，or complete media（eg，RPMI media containing 10% FBS）
- 细胞刺激剂
- 溶血/固定液：BD Phosflow Lyse/Fix Buffer，5X（货号：558049）
- 双蒸水
- 染色液：BD Pharmingen Stain Buffer（FBS）（货号：554656）
- 破膜/清洗液：BD Phosflow Perm/Wash Buffer Ⅰ，10X（货号：557885），BD Phosflow Perm Buffer Ⅱ（货号：558052）、BD Phosflow Perm Buffer Ⅲ（货号：558050）、BD Phosflow Perm Buffer Ⅳ，10X（货号：560746）
- Fc阻断抗体：BD Pharmingen Fc Block antibody（optional）（货号：553141或553142）
- BD Phosflow荧光染料标记的磷酸化蛋白抗体
- BD荧光染料标记的细胞表面抗体（optional）
参考文献
1. Sagi Y, Landrigan A, Levy R, Levy S.Complementary costimulation of human T-cellsubpopulations by cluster of differentiation 28(CD28) and CD81. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012Jan 31;109(5):1613-8. doi:10.1073/pnas.1121307109. Epub 2012 Jan 17.PMID: 22307619: PMCID: PMC3277132